چرا RNA حساس‌تر از DNA است؟
RNA تک‌رشته و از نظر شیمیایی ناپایدار است و آنزیم‌های RNase در پوست، بزاق و سطوح محیط همه‌جا حضور دارند. یک تماس کوتاه دست بدون دستکش یا ابزار آلوده میتواند کل نمونه را تخریب کند. دما هم دشمن RNA است؛ نگهداری در دمای اتاق تخریب را تسریع می‌کند. بنابراین مهار RNase از لحظهٔ نمونه‌گیری تا الوشن نهایی اصل اول است.
روش‌های اصلی و انتخاب آن‌ها
روش‌های رایج عبارت‌اند از معرف‌های فنل-گوانیدینیومی، ستون‌های سیلیکایی و ذرات مغناطیسی. بافت‌های سخت یا نمونه‌های پر از بازدارنده با کیت‌های تخصصی بهتر جواب می‌دهند و RNAهای کوچک مانند miRNA نیز پروتکل مخصوص می‌خواهند. انتخاب روش به نوع بافت و کاربرد پایین‌دستی بستگی دارد؛ یک پروتکل واحد برای همهٔ نمونه‌ها وجود ندارد.
| چالش | نشانه | راه‌کار |
|---|---|---|
| آلودگی RNase | اسمیر و ناپدیدشدن باندها | سطح و ابزار عاری از RNase و کار سریع روی یخ |
| آلودگی DNA ژنومی | باندهای اضافی در ژل | تیمار DNase و کنترل واکنش |
| خلوص پایین ۲۶۰/۲۳۰ | مهار آنزیمی در آزمون پایین‌دستی | افزودن مرحلهٔ شست‌وشو |
کنترل کیفیت RNA
نسبت ۲۶۰/۲۸۰ نزدیک ۲ نشانهٔ خلوص خوب است؛ ۲۶۰/۲۳۰ پایین یعنی نمک یا باقی‌ماندهٔ معرف. یکپارچگی RNA روی ژل با دو باند واضح ریبوزومی بررسی می‌شود و برای آزمون‌های حساس، شاخص عددی RIN معیار دقیق‌تری است. برای توالی‌یابی یا پنل بیان، سخت‌گیری بیشتری لازم است؛ کیفیت باید پیش از آزمون اصلی سنجیده شود.
نکات عملی که نتیجه را نجات می‌دهد
RNA استخراجی معمولاً بلافاصله به cDNA تبدیل می‌شود یا برای سنجش بیان ژن به کار می‌رود.
- نمونه‌گیری سریع و نگهداری در مهارکنندهٔ RNase یا انجماد فوری
- سطوح، میکروتیوب‌ها و آب عاری از RNase؛ تعویض مکرر دستکش
- کار روی یخ و پرهیز از توقف بین مراحل
- الیکوت و نگهداری در منفی ۸۰ درجه؛ پرهیز از ذوب مکرر
کیفیت RNA، اعتبار دادهٔ نهایی
تکرارپذیری سنجش بیان ژن مستقیماً به کیفیت RNA وابسته است؛ RNA تخریب‌شده حتی با بهترین طراحی آغازگر دادهٔ معتبر نمی‌دهد. به همین دلیل دستوا کنترل کیفیت را پیش از هر آزمون پایین‌دستی انجام می‌دهد. جزئیات در صفحهٔ خدمات و فهرست کامل در کاتالوگ آزمون‌ها آمده است.
سفارش استخراج RNA از دستوا
برای نمونه‌های باارزش، خدمات آزمایشگاهی استخراج RNA دستوا را انتخاب کنید؛ گزارش کیفیت همراه نمونهٔ تحویلی ارائه می‌شود. برای پروژه‌های بیان ژن با نمونهٔ فراوان، استخراج یکجا با پروتکل واحد تکرارپذیری را بالا می‌برد. نوع نمونه و تعداد را از طریق فرم درخواست پیش‌فاکتور اعلام کنید.