از یک واکنش تا میلیون‌ها خوانش
توالییابی نسل جدید به‌جای یک قطعه، میلیون‌ها مولکول DNA را هم‌زمان تعیین توالی میکند. ابتدا کتابخانه ساخته میشود: DNA قطعه‌قطعه شده و آداپتورها و بارکد اختصاصی هر نمونه به انتهای قطعات متصل میشود؛ سپس خوشه‌های مولکولی تکثیر می‌شوند و در هر چرخهٔ سنتز، بازِ خوانده‌شده با سیگنال فلورسانت ثبت میشود.
خروجی خام، میلیون‌ها خوانش کوتاه است که با ابزارهای بیوانفورماتیکی هم‌چین یا به ژنوم مرجع متصل می‌شوند. کیفیت هر باز با امتیاز Q ارزیابی میشود؛ Q۳۰ یعنی احتمال خطا یک در هزار. خوانش‌های بی‌کیفیت پیش از تحلیل حذف می‌شوند.
خوانش کوتاه، عمق زیاد
طول خوانش این پلتفرم‌ها معمولاً صدها جفت‌باز است؛ در مقابل، شمار بالای خوانش‌ها از هر ناحیهٔ هدف عمق پوشش زیادی می‌سازد. خوانش کوتاه، تحلیل نواحی تکراری ژنوم را دشوار میکند و خطای هر باز به‌تنهایی از سانگر بیشتر است؛ به همین دلیل یافته‌های حساس با روش سانگر تأیید می‌شوند.
| معیار | سانگر | NGS |
|---|---|---|
| طول خوانش | ۸۰۰ تا ۹۰۰ جفت‌باز | معمولاً ۱۵۰ تا ۳۰۰ جفت‌باز |
| توان عملیاتی | یک واکنش برای یک قطعه | میلیون‌ها خوانش هم‌زمان |
| هزینهٔ هر باز | بیشتر | بسیار کمتر |
| کاربرد اصلی | تأیید و بررسی نقطهای | ژنوم‌وسیع و پنل‌های بزرگ |
کاربردها: متاژنومیکس و فراتر از آن
در متاژنومیکس، DNA جامعهٔ میکروبی بدون نیاز به کشت بررسی میشود؛ این همان توانایی است که روش‌های مبتنی بر کشت ندارند. پیش از سفارش، کیفیت مادهٔ اولیه را جدی بگیرید؛ نتیجهٔ NGS به اندازهٔ کیفیت DNA استخراج‌شده اعتبار دارد.
- متاژنومیکس آمپلیکونی با ژن ۱۶S rRNA و نواحی ITS
- توالییابی کل ژنوم باکتری‌ها و بررسی ژن‌های مقاومت
- پنل‌های ژنی هدفمند برای ژن‌های مشخص
- توالییابی RNA برای سنجش بیان ژن
آماده‌سازی نمونه و طراحی آزمایش
- DNA سالم با نسبت ۲۶۰/۲۸۰ نزدیک ۱٫۸ و بدون شکستگی شدید
- غلظت‌سنجی دقیق با روش فلورومتری، نه صرفاً اسپکتروفتومتری
- پرهیز از انجماد و ذوب مکرر نمونه
- انتخاب پلتفرم، عمق خوانش و نوع کتابخانه بر اساس پرسش پژوهش
چهار گام جدانشدنی
طراحی آزمایش، ساخت کتابخانه، تعیین توالی و تحلیل بیوانفورماتیکی چهار مرحله‌ای هستند که کیفیت هر یک بر دیگری اثر می‌گذارد. بخش عمدهٔ زمان صرف تحلیل داده میشود. دستوا مسیر کامل از مشاورهٔ طراحی تا گزارش تحلیل را در خدمات آزمایشگاهی خود ارائه می‌دهد؛ برای برآورد هزینه، صفحهٔ تعرفه‌ها را ببینید.
سفارش توالییابی NGS از دستوا
هدف و نوع نمونه را برای کارشناسان دستوا شرح دهید تا پلتفرم و عمق مناسب پیشنهاد شود؛ شروع کار با تکمیل فرم درخواست پیش‌فاکتور ساده‌ترین مسیر است.